Pregabalin non è un agonista del recettore GABAA o GABAB.
Il pregabalin è un gabapentinoide e agisce inibendo alcuni canali del calcio.In particolare è un ligando del sito della subunità α2δ ausiliaria di alcuni canali del calcio voltaggio-dipendenti (VDCC), e quindi agisce come un inibitore dei VDCC contenenti subunità α2δ.Esistono due subunità α2δ che legano i farmaci, α2δ-1 e α2δ-2, e pregabalin mostra un'affinità simile per (e quindi mancanza di selettività tra) questi due siti.Il pregabalin è selettivo nel suo legame con la subunità VDCC α2δ.Nonostante pregabalin sia un analogo del GABA, non si lega ai recettori GABA, non si converte in GABA o in un altro agonista del recettore GABA in vivo e non modula direttamente il trasporto o il metabolismo del GABA.Tuttavia, è stato scoperto che pregabalin produce un aumento dose-dipendente dell'espressione cerebrale della decarbossilasi dell'acido L-glutammico (GAD), l'enzima responsabile della sintesi del GABA, e quindi può avere alcuni effetti GABAergici indiretti aumentando i livelli di GABA nel cervello.Al momento non ci sono prove che gli effetti di pregabalin siano mediati da alcun meccanismo diverso dall'inibizione dei VDCC contenenti α2δ.Di conseguenza, l'inibizione dei VDCC contenenti α2δ-1 da parte di pregabalin sembra essere responsabile dei suoi effetti anticonvulsivanti, analgesici e ansiolitici.
Gli α-aminoacidi endogeni L-leucina e L-isoleucina, che assomigliano molto al pregabalin e agli altri gabapentinoidi nella struttura chimica, sono ligandi apparenti della subunità α2δ VDCC con affinità simile ai gabapentinoidi (p. es., IC50 = 71 nM per L- isoleucina) e sono presenti nel liquido cerebrospinale umano a concentrazioni micromolari (p. es., 12,9 μM per L-leucina, 4,8 μM per L-isoleucina).È stato teorizzato che possano essere i ligandi endogeni della subunità e che possano antagonizzare in modo competitivo gli effetti dei gabapentinoidi.Di conseguenza, mentre i gabapentinoidi come il pregabalin e il gabapentin hanno affinità nanomolari per la subunità α2δ, le loro potenze in vivo sono nell'intervallo micromolare basso e si dice che la competizione per il legame degli L-amminoacidi endogeni sia probabilmente responsabile di questa discrepanza.

In uno studio è stato riscontrato che pregabalin possiede un'affinità 6 volte maggiore rispetto al gabapentin per i VDCC contenenti subunità α2δ.Tuttavia, un altro studio ha rilevato che pregabalin e gabapentin avevano affinità simili per la subunità α2δ-1 ricombinante umana (Ki = 32 nM e 40 nM, rispettivamente).In ogni caso, pregabalin è da 2 a 4 volte più potente del gabapentin come analgesico e, negli animali, sembra essere da 3 a 10 volte più potente del gabapentin come anticonvulsivante.