Pregabalin non è un agonista dei recettori GABAA o GABAB.
Il pregabalin è un gabapentinoide e agisce inibendo alcuni canali del calcio. Nello specifico è un ligando del sito della subunità ausiliaria α2δ di alcuni canali del calcio voltaggio-dipendenti (VDCC), e quindi agisce come un inibitore dei VDCC contenenti subunità α2δ. Esistono due subunità α2δ che legano il farmaco, α2δ-1 e α2δ-2, e pregabalin mostra un'affinità simile per (e quindi una mancanza di selettività tra) questi due siti. Pregabalin è selettivo nel suo legame con la subunità α2δ VDCC. Nonostante pregabalin sia un analogo del GABA, non si lega ai recettori GABA, non si converte in GABA o in un altro agonista dei recettori GABA in vivo e non modula direttamente il trasporto o il metabolismo del GABA. Tuttavia, è stato scoperto che pregabalin produce un aumento dose-dipendente dell'espressione cerebrale della decarbossilasi dell'acido L-glutammico (GAD), l'enzima responsabile della sintesi del GABA, e quindi può avere alcuni effetti GABAergici indiretti aumentando i livelli di GABA nel cervello. Attualmente non ci sono prove che gli effetti del pregabalin siano mediati da meccanismi diversi dall’inibizione dei VDCC contenenti α2δ. Di conseguenza, l’inibizione dei VDCC contenenti α2δ-1 da parte del pregabalin sembra essere responsabile dei suoi effetti anticonvulsivanti, analgesici e ansiolitici.
Gli α-amminoacidi endogeni L-leucina e L-isoleucina, che somigliano molto al pregabalin e agli altri gabapentinoidi nella struttura chimica, sono ligandi apparenti della subunità α2δ VDCC con affinità simile a quella dei gabapentinoidi (ad esempio, IC50 = 71 nM per L- isoleucina) e sono presenti nel liquido cerebrospinale umano a concentrazioni micromolari (p. es., 12,9 μM per L-leucina, 4,8 μM per L-isoleucina). È stato teorizzato che potrebbero essere i ligandi endogeni della subunità e che potrebbero antagonizzare competitivamente gli effetti dei gabapentinoidi. Di conseguenza, mentre i gabapentinoidi come pregabalin e gabapentin hanno affinità nanomolari per la subunità α2δ, le loro potenze in vivo sono nell'intervallo micromolare basso e si ritiene che la competizione per il legame da parte degli amminoacidi L endogeni sia probabilmente responsabile di questa discrepanza.

In uno studio è stato scoperto che pregabalin possiede un'affinità 6 volte maggiore rispetto a gabapentin per i VDCC contenenti subunità α2δ. Tuttavia, un altro studio ha rilevato che pregabalin e gabapentin avevano affinità simili per la subunità α2δ-1 ricombinante umana (Ki = 32 nM e 40 nM, rispettivamente). In ogni caso, il pregabalin è da 2 a 4 volte più potente del gabapentin come analgesico e, negli animali, sembra essere da 3 a 10 volte più potente del gabapentin come anticonvulsivante.